Исследование агрегационной способности тромбоцитов

В неповреждённом сосуде тромбоциты не взаимодействуют друг с другом и не адгезируют за счёт электростатического отталкивания от эндотелия. Реакция тромбоцитов на внешние стимулы зависит от соотношения внеклеточных сигналов, активирующих и ингибирующих активность клеток. Мембрана тромбоцитов содержит рецепторы для многих индукторов их активации и ингибиторов. На мембране тромбоцитов человека выявлено около 30 участков рецепторного связывания биологически активных соединений разнообразной химической природы.

Физиологические стимуляторы активности тромбоцитов можно разделить на две группы: слабые (АДФ в концентрации менее 1 мкМ, вазопрессин, адреналин, серотонин) и сильные (тромбин, коллаген, тромбоксан А2, фактор активации тромбоцитов) агонисты. К антагонистам относят простагландин I2 (простациклин), простагландин D2, NO (окись азота, эндотелиальный релаксирующий фактор) . В месте образования сосудистого дефекта ( в результате механического повреждения, воздействия химического вещества, изъязвления атеросклеротической бляшки) экспонируются молекулы адгезии (адгезивные белки служат "центрами притяжения" циркулирующих в крови тромбоцитов) эндотелиального происхождения: фибронектин, ламинин, фактор Виллебранда, витронектин и др. Так, взаимодействие фактора фон Виллебранда с тромбоцитами опосредовано гликопротеиновыми комплексами Ia и Ib. Фактор Виллебранда представляет собой гликопротеин массой 106 Да. Его синтезируют васкулярные эндотелиальные клетки, а также в небольшом количестве он присутствует в тромбоцитах и плазме крови.

Уменьшение концентрации этого фактора и его функциональная пассивность вызывают нарушение адгезии тромбоцитов к субэндотелию и увеличение времени кровотечения. При ишемической болезни сердца, атеросклерозе, сахарном диабете увеличивается адгезивность. Механизм этого процесса пока не известен.

Полагают, что важную роль в этом случае может играть недостаточное образование простациклина.

В зависимости от степени выраженности тромбоцитарные ответы можно разделить на три типа.

• Первый тип - обратимый ответ, включающий первые три стадии активации. Он реализуется при действии слабых агонистов. В этом случае полная активация не обеспечивается, тромбоцитарный агрегат распадается, тромбоциты могут вернуться в своё пер во начальное дисковидное состояние.

• Второй тип - необратимый ответ тромбоцитов на действие сильных агонистов, при нём происходят выброс содержимого α-гранул, плотных гранул и необратимая агрегация.

• Третий тип - реакция дезагрегации, индуцируемая антагонистами.

Фиксация тромбоцита к повреждённым структурам сосуда создаёт предпосылки для эффективного взаимодействия тромбоцита с главным белком соединительной ткани - коллагеном. Последовательность биохимических процессов, лежащих в основе индуцированной коллагеном активации тромбоцита, условно можно разделить на пять последовательных биохимических стадий.

I стадия

Инициация активации тромбоцитарного звена гемостаза обусловлена образованием комплекса коллагена со специфическим мембранным рецептором коллагена.

Результатом этого взаимодействия становится активация мембраносвязанного фермента фосфолипазы А2 с образованием двух продуктов - арахидоновой кислоты и лизоформа (предшественник) фактора активации тромбоцитов. Субстратом этой реакции служит молекула фосфолипида, содержащего во втором положении глицеринового остатка арахидоновую кислоту. Чаще всего в качестве субстрата выступает молекула фосфатидилхолина, преимущественно содержащегося во внешнем слое наружной плазматической мембраны тромбоцита: на его долю приходится приблизительно 26% общего содержания липидов в плазматической мембране.

Под действием фермента циклооксигеназы арахидоновая кислота быстро конвертируется в циклические эндоперекиси - простагландин G2 и простагландин Н2 - короткоживущие высокореакционные соединения, которые по механизму отрицательной обратной связи ингибируют активность циклооксигеназы. Продукт реакции, катализируемой ферментом тромбоксансинтетазой, - тромбоксан А2 - мощный индуктор агрегации и вазоконстриктор. Другой сильный индуктор агрегации - фактор активации тромбоцитов. Он образуется из своего предшественника путём ферментативного ацетилирования с помощью ацетилтрансферазы.

Таким образом, в ходе первой стадии активации тромбоцитов образуются два активных стимулятора, при этом их конечные внутриклеточные концентрации значительно превышают количество активных "сайтов" коллагена. Основные принципы каскадного механизма активации тромбоцитов - усиление активирующего сигнала и его конвергенция - находят отражение и в последующих стадиях активации. Следует отметить, что 1 этап агрегации обычно не сопровождается заметными изменениями формы и адгезивных способностей тромбоцитов.

Терминация стимулирующего сигнала тромбоксана А2 и фактора активации тромбоцитов осуществляется ферментами их метаболизма, максимальное содержание которых обнаружено в лёгких. В результате быстрой инактивации период полужизни эйкозаноидов не превышает 1 мин.

Чтобы произошла агрегация тромбоцитов, помимо их активации агонистамииндукторами агрегации необходимо наличие ионов Са2+, так как агрегация тромбоцитов связана с внутриклеточным обменом Са2+ (мобилизация кальция из плотной тубулярной системы в цитоплазму).

К фармакологическим соединениям, ингибирующим данную стадию активации тромбоцитов и широко используемым в неврологической практике, относят ингибиторы циклооксигеназы. В зависимости от механизма действия их делят на препараты необратимого типа действия (ацетилсалициловая кислота) и обратимые ингибиторы циклооксигеназы. Приём 500 мг ацетилсалициловой кислоты приводит к инактивации циклооксигеназы всех циркулирующих тромбоцитов крови. Поскольку отсутствие ядра не позволяет тромбоцитам ресинтезировать новый фермент, они теряют способность продуцировать эйкозаноиды, прежде всего тромбоксан А2. Ацетилсалициловая кислота также угнетает активность циклооксигеназы эндотелиальных клеток, но они способны регенерировать новый фермент в течение нескольких часов. Поэтому идеальная терапия ацетилсалициловой кислотой предполагает использование низких доз, при этом ингибируется синтез тромбоксана А2 в тромбоцитах и быстро восстанавливается синтез простагландина I2 в эндотелии. Этому условию соответствует приём ацетилсалициловой кислоты из расчёта 1 мг/кг/сут. Свойством обратимо ингибировать тромбоцитарную циклооксигеназу обладают такие НПВС, как фенилбутазон, индометацин, индобуфен, напроксен.

2 стадия

Ауто- и паракринный механизм активации тромбоцитов под действием фактора активации тромбоцитов и тромбоксана А2 опосредован специфическими мембранными рецепторами и определяется стимуляцией активности мембраносвязанного фермента фосфолипазы С. Результатом ферментативного гидролиза минорного фосфолипида фосфатидилинозитолдифосфата становится образование двух соединений - l,4,5-инозитолтрифосфата и диацилглицерина, обладающих свойствами вторичных внутриклеточных посредников. 1,4,5-инозитолтрифосфат -гидрофильное соединение, мобилизующее ионизированный Са2+ из его внутриклеточных депо (плотной тубулярной системы и других структурных образований эндоплазматического ретикулума тромбоцитов). Молекулярной мишенью действия диацилглицерина служит мультифункциональный мембраносвязанный фермент протеинкиназа С, осуществляющий фосфорилирование различных внутриклеточных белков по сериновым и треониновым остаткам. Регуляторная роль протеинкиназы С сводится к запуску внутриклеточных механизмов снижения концентрации свободных ионов кальция в цитоплазме тромбоцита . .эти механизмы включают фосфорилирование и последующее ингибирование активности рецептор-управляемых кальциевых каналов плазматической мембраны.

Примером отрицательной обратной связи служит активация под действием протеинкиназы С фермента 3-фосфомоноэстеразы, участвующего в метаболизме 1,4,5-инозитолтрифосфата до инозитолдифосфата.

Таким образом, ключевое звено 2 этапа активации тромбоцитов - мобилизация ионов кальция из внутриклеточных депо. Ионизированный кальций - основной регулятор последовательности тромбоцитарной активации.

Фармакологическая регуляция активности тромбоцитов на данном этапе включает воздействие на рецепторы фактора активации тромбоцитов, тромбоксана А2 и внутриклеточный обмен ионов кальция. Антагонисты рецепторов тромбоксана А2 - (з-пиридинил)алканоевые и (арилсульфониламино)алканоевые кислоты.

Проведённые клинические испытания продемонстрировали эффективность этих классов соединений in vivo при ангиопластике, сахарном диабете, беременности, артериальной гипертензии, кардио- и цереброваскулярных заболеваниях, сопровождающихся увеличением синтеза тромбоксана.

3 стадия

К основным внутриклеточным процессам, находящимся под контролем внутриклеточного содержания кальция, относят следующие.

• Положительная модуляция активности мембранных фосфолипаз А2 и С.

• Экспрессия на поверхности клетки гликопротеиновых рецепторов фибриногена и интегриновых комплексов (экспозиция некоторых факторов адгезии не является Са-зависимым процессом) .

• Ингибирование аденилатциклазного и гуанилатциклазного путей, тормозящих стимуляцию тромбоцитов.

• Работа сократительного аппарата тромбоцитов, обусловливающая изменение формы тромбоцита, адгезивную активность, секрецию и высвобождение содержимого внутриклеточных гранул.

Чтобы проявилось влияние Са2+ на большинство из перечисленных процессов, необходимо предварительное образование комплекса четырёх ионов кальция с кальмодулином - специфическим кальцийсвязывающим белком, относящимся к семейству S-1О0-белков. Образованный комплекс (Са-кальмодулин) обладает способностью активировать киназу лёгких цепей миозина, стимулируя секрецию и дегрануляцию. Другие мишени действия комплекса Са-кальмодулин - аденилатциклаза и гуанилатциклаза. Их фосфорилирование Са-кальмодулинзависимыми протеинкиназами вызывает снижение их ферментативной активности и последующее уменьшение внутриклеточного содержания циклических нуклеотидов - цАМФ и цГМФ соответственно. Взаимодействие комплекса Са-кальмодулин с фосфодиэстеразой цАМФ, напротив, вызывает стимуляцию активности этого фермента и, как следствие, ускоренный метаболизм цАМФ до неактивного АМФ.

Антагонисты кальмоцулина - производные l,4-дигидропиридина, фенотиазина (трифтазин) - вызывают конформационные изменения в молекуле кальмодулина, нарушая его способность связывать кальций. Угнетение функциональной активности тромбоцитов у этих соединений соответствует степени сродства к кальмодулину.

3 стадия соответствует фазе первичной (обратимой) агрегации тромбоцитов.

Возможность перехода тромбоцитов из III в IV стадию активации определяется как внутриклеточными механизмами регуляции, снижающими концентрацию свободных ионов кальция в цитоплазме тромбоцита, так и тормозными экстраклеточными стимулами, действие которых реализуется через аденилатциклазную и гуанилатциклазную систему трансдукции сигнала. Если рассматривать экстраклеточный уровень, то решающее значение здесь имеют простациклин и NO.

В тромбоцитах эту тормозящую роль играют цАМФ и цГМФ.

Клетки эндотелия постоянно выделяют простациклин в кровоток. Связываясь со специфическими рецепторами на мембране тромбоцитов, он активирует aдeнилатциклазу, повышает внутриклеточное содержание цАМФ и снижает концентрацию ионов кальция. Синтез простациклина в клетках эндотелия включает те же реакции, что и синтез тромбоксана А2 в тромбоцитах. Отличие проявляется в заключительной стадии синтеза, когда под действием простациклинсинтетазы простагландин Н2 превращается в простагландин I2.

Гуанилатциклаза катализирует переход ГТФ в цГМФ. Увеличение внутриклеточного содержания цГМФ ингибирует последующие тромбоцитарные ответы через угнетение активности фосфолипида С. Указанный путь торможения агонистиндуцированного ответа тромбоцитов характерен для NO, который вызывает селективную активацию гуанилатциклазы, связываясь с гемовой группировкой этого фермента. NО-синтетаза присутствует в различных клетках, включая макрофаги, нейтрофилы, эндотелиальные клетки, тромбоциты. Этот фермент: используя L-аргинин как субстрат, генерирует NO и L-цитрулин В качестве метаболита. Метиловый эфир L-аргинина - специфический ингибитор NО-синтетазы. Основной путь уменьшения концентрации свободных ионов кальция в цитоплазме тромбоцита - активация Ca-АТФаз плотной тубулярной системы и плазматической мембраны, уменьшающих внутриклеточное содержание кальция за счёт его обратного захвата во внутриклеточные депо (ресеквестрация) и выброса Са2+ из клетки. Кальцийблокирующий эффект циклических нуклеотидов опосредован специфическими цАМФ- и цГМФ-зависимыми протеинкиназами. В то же время не исключено, что часть эффектов циклических нуклеотидов обусловлена их прямым воздействием на активность протеинкиназы С, фосфолипазы С и А2. Стимуляторы аденилатциклазы и гуанилатциклазы ведут к быстрому снижению концентрации свободных ионов кальция в цитоплазме тромбоцита, они способны блокировать активацию тромбоцитов в любой её стадии. Напротив, способность адреналина вызывать агрегацию тромбоцитов обусловлена снижением активности аденилатциклазы, опосредованным α1-адренорецепторами.

• Активаторы аденилатциклазы - стабильный аналог простациклина эпопростенолР, аденозин, простагландины Е1 и D2

• Дипиридамол по механизму действия относят к конкурентным блокаторам захвата аденозина различными типами клеток, он пролонгирует антиагрегантное действие аденозина.

• Активаторы гуанилатциклазы - органические нитраты и нитросодержащие препараты, такие как нитроглицерин, изосорбида мононитрат, нитропруссид натрия, молсидомин. Этот класс соединений успешно используют при кардиоваскулярных расстройствах, но концентрации этих препаратов, в которых они способны ингибировать активность тромбоцитов, значительно выше терапевтических. Их положительный эффект, скорее всего, обусловлен вазодилатацией.

Другой путь повышения содержания цАМФ - подавление активности фосфодиэстеразы цАМФ. К ингибиторам этого фермента относят производные ксантина - пентоксифиллин, кофеин, теофиллин.

4 стадия

4 стадия - стадия дегрануляции. В ходе реакции высвобождения из тромбоцитов через открытую канальцевую систему выделяются АДФ, фактор активации тромбоцитов, вазопрессин, серотонин, адреналин, тромбоксан A2, вовлекающие в процесс агрегации другие тромбоциты. Тромбоксан A2 и серотонин (посредством активации 5-НТ2a -рецепторов) , обладая вазоконстрикторным действием, обусловливают скопление тромбоцитов в месте повреждения, локализуя процесс. Важный процесс для развития необратимой агрегации - высвобождение во внеклеточное пространство АДФ. Мембранные рецепторы АДФ относят к классу Р2x-пуриновых рецепторов, одновременно они служат Са-каналами. Активация этих рецепторов вызывает вход в клетку внеклеточного Ca2+ по градиенту концентрации.

К фармакологическим соединениям, ингибирующим данную стадию активации тромбоцитов, относят:

• препараты, вызывающие деструкцию сократительного аппарата, - винкристин, колхицин;

• блокаторы кальциевых каналов - верапамил, нифедипин, дилтиазем.

5 стадия

Конечные этапы активации тромбоцитов связаны с экспозицией рецепторов фибриногена - гликопротеинового комплекса IIb- IПа на поверхности тромбоцитов.

Препараты тиклопидин и клопидогрел ингибируют экспрессию гликопротеиновых комплексов Пb-IПа и блокируют трансформацию этого комплекса в высокоаффинный лигандсвязывающий сайт. Действие этих препаратов длительное, максимальный эффект наступает через 3-7 дней.

Следует отметить, что каскадная система включения и активации факторов, регулирующих внутриклеточную концентрацию ионов кальция - основного индикатора активности тромбоцитов, отличается надёжностью и динамичностью.

Для неё характерны множественность путей про ведения сигнала, дублирование и взаимозаменяемость элементов, быстрый возврат к равновесному состоянию.

Этим обусловлена сложность адекватного фармакологического вмешательства в работу каскадной системы активации тромбоцитов.

Исследование агрегационной способности тромбоцитов целесообразно про водить до И во время антиагрегантной терапии, чтобы подобрать адекватную дозу антиагреганта и контролировать эффективность антитромботической терапии.

Интерпретация результатов исследования агрегационной способности тромбоцитов кратко резюмирована в табл. 2-6.

Таблица 2-6. Оценка результатов анализа агрегационной способности тромбоцитов

Заболевание Активаторы агрегации
  АДф Коллаген Ристоцетин
Дефект рецептора коллагена Нормальная агрегация Агрегация отсутствует или снижена Нормальная агрегация
Синдром Бернара-Сулье Нормальная агрегация Нормальная агрегация Агрегация отсутствует или снижена
Синдром Виллебранда тромбоцитарного типа Нормальная агрегация Нормальная агрегация Агрегация в 1 ,5-2 раза выше нормы
Тромбастения Гланцманна Агрегация отсутствует Агрегация отсутствует Нормальная агрегация
Дефицит пулов хранения Отсутствует вторая волна агрегации Агрегация отсутствует или снижена Нормальная агрегация
Нарушение метаболизма арахидоновой кислоты Отсутствует вторая волна агрегации Агрегация отсутствует или снижена Нормальная агрегация
Другие нарушения активации тромбоцитов Отсутствует вторая волна агрегации Агрегация отсутствует или снижена Нормальная агрегация

© 2014 Медицина для врачей и студентов медиков на MedSecret.net.
При копировании активная ссылка на MedSecret.net обязательна.